提高基因组编辑程序的效率以修改最初无法访问的DNA序列

海德堡大学生物研究中心发育生物学/生理学系的研究人员在优化基因组编辑关键流程的过程中，成功大幅提高了CRISPR/Cas9等分子遗传学方法及相关系统的效率，拓宽其应用领域。

与其他学科的同事一起，生命科学家们对这些工具进行了微调，以实现对特定基因突变建模的有效基因筛选。此外，现在可以修改最初无法访问的DNA序列。根据JoachimWittbrodt教授的说法，这为基础研究和潜在的治疗应用开辟了广泛的新工作领域。

基因组编辑是指用分子遗传学方法故意改变DNA。它用于培育植物和动物，也用于基础医学和生物学研究。最常见的程序包括“基因剪刀”CRISPR/Cas9及其称为碱基编辑器的变体。在这两种情况下，酶都必须被转运到靶细胞的细胞核中。到达后，CRISPR/Cas9系统在特定位点切割DNA，导致双链断裂。然后可以在该位点插入新的DNA片段。

碱基编辑器使用类似的分子机制，但它们不切割DNA双链。相反，一种与Cas9蛋白结合的酶会进行核苷酸的靶向交换——核苷酸是基因组的基本组成部分。在连续的三项研究中，Wittbrodt教授的团队成功地大大提高了这些方法的效率和适用性。

使用CRISPR/Cas9时的一个挑战在于将所需的Cas9酶有效地递送至细胞核。“细胞有一个精心设计的‘弹跳器’机制。它区分允许转移到细胞核中的蛋白质和应该留在细胞质中的蛋白质，”来自Wittbrodt教授团队的TinatiniTavhelidse-Suck博士解释说。此处的访问是通过一个由一些氨基酸组成的标签实现的，其功能类似于“入场券”。

科学家们现在想出了一种普遍有效的“贵宾入场券”，可以让搭载它的酶快速进入细胞核。他们将其命名为“highefficiency-tag”，简称“hei-tag”。“其他必须穿透细胞核的蛋白质在使用‘hei-tag’时也更成功，”ThomasThumberger博士说，他也是有机体研究中心(COS)的研究员。

通过与海德堡大学的药理学家合作，该团队可以证明，与“hei-tag”票证相关的Cas9不仅可以在模式生物青鳉、日本米鱼(Oryziaslatipes)中实现高效、有针对性的基因组改变，而且在哺乳动物细胞培养物和小鼠胚胎中。

在进一步的研究中，海德堡的科学家表明，碱基编辑器在生物体中的运作非常高效，甚至适用于基因筛选。在对日本稻米鱼进行的一项实验中，他们能够证明，这些在DNA的各个构建块中进行的局部有限的、有针对性的修改实现了一种结果，否则只能通过相对费力的基因改变的生物体繁殖才能获得。

COS的研究团队与海德堡大学医院的儿科心脏病专家JakobGierten博士合作，专注于某些基因突变。这些突变被怀疑会引发人类先天性心脏缺陷。通过修改模式生物中相关基因DNA的单个构建块，科学家们能够模仿和研究具有所述心脏缺陷的鱼胚胎。

维特布罗德教授团队这项研究的两位第一作者BettinaWelz和AlexCornean博士说，有针对性的干预已经在鱼类胚胎发育的早期阶段导致心脏发生明显变化。这使研究人员能够证实最初的怀疑，并在基因改变和临床症状之间建立因果关系。

通过专门开发的软件ACEofBASEs，可以对鱼类胚胎的基因组进行精确干预，该软件可在线获取。它允许识别非常有效地导致目标基因和所得蛋白质发生所需变化的遗传位置。科学家们说，日本稻鱼是一种极好的遗传模型生物，可以模拟从各个患者身上发现的突变。JakobGierten说：“我们的方法可以进行有效的筛查分析，因此可以为开发个性化医疗提供一个起点。”

第三项研究同样来自Wittbrodt小组，涉及碱基编辑器的局限性。对于这样的编辑器来结合目标细胞的DNA，必须有特定的序列基序。它被称为ProtospacerAdjacentMotif，简称PAM。“如果在要改变的DNA构建块附近缺少这个基序，就不可能交换核苷酸，”Thumberger博士解释说。在他的领导下，一个团队现在已经找到了绕过这个限制的方法。

连续使用单个单元格中的两个碱基编辑器。在初始步骤中，为另一个碱基编辑器生成一个新的DNA结合基序，在此基础上，同时应用的第二个编辑器可以编辑以前无法访问的站点。该研究的第一作者KaisaPakari解释说，这种交错使用被证明是非常有效的。通过这一技巧，海德堡科学家能够将已建立的碱基编辑器的可能应用位点数量增加65%。现在也可以修改最初无法访问的DNA序列。

JoachimWittbrodt强调说：“优化现有的基因组编辑工具及其微调应用会为基础研究和潜在的新治疗方法带来巨大的可能性。”