如何准确测定样品中蛋白质的含量 旋涡混合器的使用方法

有关如何准确测定样品中蛋白质的含量和旋涡混合器的使用方法的知识相信很多人都不甚了解，今天六月小编为大家整理了关于这方面的知识，让我们一起来看下吧!

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一、如何准确测定样品中蛋白质的含量

一、如何准确测定样品中蛋白质的含量

5蛋白质含量的测定方法一、微量凯氏定氮法样品用浓硫酸加热。含氮有机物分解产生氨(消化)，氨与硫酸反应生成硫酸铵。碱化后分解释放出氨，用蒸汽将氨蒸成酸性溶液。根据这种酸性溶液的中和程度，可以计算出样品的氮含量。二、缩二脲法(Biret法)1、实验原理。

缩二脲是两个尿素分子在180左右加热，释放出一个氨分子的产物。在强碱性溶液中，缩二脲与硫酸铜生成紫色络合物，称为缩二脲试验。所有有两个酰胺基或两个直接相连的肽键，或可以通过一个中间碳原子相连的肽键的化合物都有缩二脲试验。

紫色络合物的颜色与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量和氨基酸组成无关，因此可以用来测定蛋白质的含量。测量范围为1-10毫克蛋白质。干扰该测定的主要物质是硫酸铵、tris缓冲液和一些氨基酸。这种方法的优点是速度快，不同蛋白质产生的颜色深浅相似，干扰物质少。主要缺点是灵敏度差。因此，双缩脲法通常用于需要快速但不是非常准确的蛋白质测定。

2、试剂及设备(1)试剂：A、标准蛋白溶液：10mg/ml标准蛋白溶液用标准结晶牛血清白蛋白或标准酪蛋白配制，其纯度可用1mg/ml bsa的a280校正为0.66。如果需要，标准蛋白也可以预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算其纯度，然后根据其纯度称量配制标准蛋白溶液。用0.9%nacl和0.05n nach制备牛血清白蛋白和酪蛋白。

b、缩二脲试剂：称取1.50g硫酸铜和6.0g酒石酸钾钠，溶于500ml水中，边搅拌边加入300ml 10% NaOH溶液，用水稀释至1升，贮存于塑料瓶(或内壁涂有石蜡的瓶子)中。这种试剂可以保存很长时间。如果储存瓶中出现黑色沉淀，则需要重新配制。(2)设备：可见光分光光度计、15支大试管、涡旋混合器等。3、操作方法

(1)标准曲线的测定：将12支试管分成两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml标准蛋白溶液，用水补足至1 ml，再加入4 ml缩二脲试剂。充分摇匀后，室温(20 ~ 25)放置30分钟，于540nm处进行比色测定。第一个没有蛋白质溶液的试管用作空白对照溶液。取两组测量值的平均值，以蛋白质含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)样品的测定：取2 ~ 3支试管，用与上述相同的方法测定未知样品的蛋白质浓度。注意，样品浓度不应超过10毫克/毫升。三、福林—酚试剂法(劳里法)1、实验原理

这种蛋白质方法是最灵敏的方法之一。在过去，这种方法是应用最广泛的方法。近年来，由于试剂B(现已可订购)制备困难，逐渐被考马斯亮蓝法取代。该方法的显色原理与双缩脲法相同，只是加入了第二试剂福林—-酚试剂，增加了显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种颜色反应之所以产生深蓝色，是因为在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合形成络合物。福林—酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物)。

在一定条件下，蓝色的深浅与蛋白质的多少成正比。福林—酚试剂法首先由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。它将在未来的生物化学领域得到广泛的应用。这种方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是耗时长，标准曲线不是严格的线性，特异性差，干扰物质多。

干扰缩二脲试验的离子也容易干扰劳里反应。而且对后者的影响要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖、甘油均有干扰作用。低浓度的尿素(0.5%)、硫酸钠(1%)、硝酸钠(1%)、三氯乙酸(0.5%)、乙醇(5%)、乙醚(5%)、丙酮(0.5%)等溶液对显色没有影响，但当这些物质的浓度较高时，必须做校准曲线。

含硫酸铵的溶液只能通过加入浓碳酸钠-氢氧化钠溶液来测定。如果样品酸度较高，显色后颜色会变浅，必须将碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度提高1 ~ 2倍。

在测定过程中，加入福林-酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph下稳定，但上述还原反应仅在ph=10时发生。因此，在碱性铜-蛋白溶液中加入福林-酚试剂时，必须立即混合，这样才能在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前发生还原反应。该方法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。该方法可检测的最小蛋白质质量为5毫克。通常测定范围为20 ~ 250毫克。2、试剂和设备

(1)试剂A和试剂A: (a)碳酸钠10g，NaOH 2g，酒石酸钾钠0.25g。溶解在500毫升蒸馏水中。(b)将0.5g硫酸铜溶于100ml蒸馏水中，每次使用前，将50份(A)和1份(b)混合，得到试剂A.

B、试剂B:加入钨酸钠100g、钼酸钠25g、蒸馏水700ml，再加入85%磷酸50ml、浓盐酸100ml，充分混合，连接回流管，小火回流10h，回流结束后加入硫酸锂150g、蒸馏水50ml、液溴数滴。

开口继续沸腾15分钟以驱除过量的溴。冷却后，溶液呈黄色(如果还是绿色，必须重复滴加液溴的步骤)。稀释至1升，过滤，并将滤液储存在棕色试剂瓶中。使用时，用标准nach滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释，加入约1倍的水，使最终酸浓度约为1n。

c标准蛋白溶液：准确称取结晶的牛血清白蛋白或球蛋白，溶于浓度约为250mg/ml的蒸馏水中。如果牛血清白蛋白在水中浑浊，可用0.9%nacl溶液代替。(2)设备A、可见分光光度计B、涡旋混合器C、秒表D、16支试管3、操作方法

(1)标准曲线的测定：取16支大试管，1支空白，3支未知样品，将剩余试管分成两组，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml标准蛋白溶液(浓度：250mg/ml)。用水将其补足至1.0 ml，然后向每个试管中加入5 ml试剂A，在涡旋混合器上快速混合，并在室温(20 ~ 25)下放置10分钟。然后逐一加入0.5 ml试剂B(福林—酚试剂)，立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

folin—酚试剂法实验表管号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质0.2 0.4 0.6 （约250mg/ml）

蒸馏水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg） 吸光度值（a700）

（2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意：由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易folin—酚试剂法

1、试剂

（1）试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n 氯化钠、10%碳酸钠、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

（2）试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

（3）标准蛋白质溶液：同基本法。

2、操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55恒温水浴中保温5分钟。

用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（bradford法）

1、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

2、试剂与器材

（1）试剂：

a、标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

b、考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

（2）器材：

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、试管16支

3、操作方法

（1）标准方法

a、取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

b、加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1ml水加5.0mg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表管号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)

蒸馏水0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝g250试剂5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg） 光吸收值（a595）

c、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。

（2）微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml水，考马斯亮蓝g250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

以上就是关于如何准确测定样品中蛋白质的含量的知识，后面我们会继续为大家整理关于旋涡混合器的使用方法的知识，希望能够帮助到大家！